В книге дан подробный анализ современных технических приемов хроматографии и возможностей новейшей аппаратуры, а также полный справочный материал по обменникам и сорбентам. Анализируются последние достижения в гель-фильтрации, распределительной, адсорбционной, ионообменной, аффинной и тонкослойной хроматографии. В каждом из методов наряду с обычной хроматографией рассмотрены достижения методов высокоэффективной хроматографии при высоком давлении в колонках и на микропластинках.
   Рассчитана на биохимиков, химиков, медиков, фармакологов, работников пищевой и микробиологической промышленности, а также на студентов и преподавателей.

ВВЕДЕНИЕ

   Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование: молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофобности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам.
   Естественно, что фракционирование по столь широкому кругу параметров реализуется путем использования достаточно разнообразных методических подходов и аппаратуры. Тем не менее, одна принципиальная особенность остается неизменной для всех этих подходов, что и позволяет объединить их в одну категорию хроматографических методов. В любом из них можно обнаружить двухфазную систему, в которой одна фаза неподвижна, а другая перемещается относительно нее с некоторой скоростью в одном определенном направлении. Неподвижная фаза остается неизменной, заполняя полость трубки (хроматографической “колонки”) или фиксируясь на поверхности стеклянной или пластиковой пластинки; иногда ее основу образует фильтровальная бумага или пленка ацетилцеллюлозы. Подвижная фаза непрерывно обновляется, поступая в систему с одного ее конца и покидая с другого. Молекулы компонентов исходной смеси веществ распределяются между двумя фазами в соответствии со степенями своего сродства к ним. На каждом участке неподвижной фазы это распределение стремится к состоянию динамического равновесия, которое непрерывно нарушается вследствие перемещения подвижной фазы. В результате постоянно идущего перераспределения молекул вещества между фазами они мигрируют в направлении течения подвижной фазы. Скорость такой миграции тем меньше, чем больше сродство молекул к неподвижной фазе. Распределение между фазами происходит независимо для каждого компонента смеси веществ. Если соотношения сродства к двум фазам у молекул разных компонентов смеси не одинаковы, то они мигрируют в направлении течения подвижной фазы, т. е. вдоль пути хроматографического разделения (например, вдоль колонки), с различными скоростями, что и позволяет физически отделить эти компоненты друг от друга в конце такого пути.
   Соотношение сродства к подвижной и неподвижной фазам может определяться доминирующей ролью тех или иных физико-химических характеристик как фракционируемых молекул, так и обеих фаз, а также их биологической специфичностью. В соответствии с этими характеристиками и природой отвечающего им сродства проводится классификация хроматографических методов, с которой начинается первая глава. Рассмотрению их практического использования в той же главе предпослан краткий теоретический анализ принципиальных особенностей любого хроматографического процесса. Этот анализ не претендует на строгость и носит качественный характер.
   Неподвижная фаза может быть твердой или жидкой, подвижная — жидкой или газообразной. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают “жидкостную” и “газовую” хроматографию. Для очистки и фракционирования белков, нулеиновых кислот и их компонентов используется почти исключительно жидкостная хроматография, поэтому (в соответствии с названием книги) мы ограничились рассмотрением только этого вида хроматографии во всех его вариантах, каждому из которых посвящена отдельная глава. Варианты жидкостной хроматографии различаются по природе сродства фракционируемых молекул к хроматографическим фазам; в соответствии с этим при изложении мы опираемся на классификацию по принципу фракционирования. Бурно развивающиеся в последние годы методы хроматографии при высоком давлении включены в состав каждой главы в виде особых разделов. Тонкослойную хроматографию, ввиду ее технического своеобразия, имеет смысл выделить в отдельную главу, хотя в рамках этой главы и приходится рассматривать различные варианты взаимодействия веществ с хроматографическими фазами.
   Характеристики и номенклатура различных специализированных продажных сорбентов (обменников, смол, пластинок и др.) включены в соответствующие главы, однако достаточно подробное рассмотрение свойств материалов матриц, па базе которых такие сорбенты изготовляются, целесообразно выделить в отдельную главу, поскольку эти свойства необходимо иметь в виду при использовании любого продажного сорбента.
   Описанию современной хрэматографической техники (колонок, насосов, детекторов, коллекторов фракций и др.) также посвящена отдельная глава. Наряду с рассмотрением принципов работы этих устройств сюда включены и сопоставляются данные каталогов по последним (на конец 1983 г.) моделям соответствующей аппаратуры, особенно многочисленным для высокоэффективной хроматографии при высоком давлении. В этой же главе приведены подробные рекомендации по общим для всех вариантов хроматографии методическим приемам: подготовке колонок, внесению препаратов, осуществлению элюции, детектированию фракций и др.
   Включенные в текст многочисленные примеры из новейшей периодической литературы предназначены только для иллюстрации определенных положений и потому цитируются лишь в той мере, которая необходима для этой цели.
   В ноябре 1983 г. состоялся 3-й Международный симпозиум по ЖХВД белков, пептидов и полинуклеотидов; его материалы опубликованы [1] (эту ссылку н все дальнейшие — см. ниже). При фракционировании белков основное внимание уделялось ускорению процесса, а не использованию возможностей ЖХВД для повышения разрешающей способности метода при умеренных скоростях элюции, хотя такая возможность была недавно подтверждена экспериментально Като и соавторами [2]. Обращает на себя внимание развитие метода фракционирования белков в снижающемся градиенте концентрации соли за счет гидрофобного взаимодействия с сорбентом [3—6]. Для гель-фильтрации белков при средних давлениях использовались мелкозернистые (3—10 мкм) концентрированные (до 20%) гели агарозы, которые выгодно отличаются от крупнопористых силикагелей меньшим уровнем сорбции и лучшим разрешением пиков [7, 8]. Джон и Шмидт показали возможность тонкого фракционирования белков на длинной (1,25 м) колонке нового мелкозернистого оксиапатита фирмы “Bio-Rad” [9]. На этом же сорбенте удалось очистить иммуноглобулины прямо из культуральной жидкости лимфобластов и гибридом [10]. Описано быстрое разделение однонитевой и двунитевой ДНК обратнофазовой ЖХВД на октадецил-силикагеле [11]. Наконец, бесспорный интерес представляет предложение использовать для очистки мРНК поли(U)-бумагу взамен олиго(dТ)-целлюлозы — это намного быстрее, а мРНК выходит в малом объеме [12]. Все большую популярность приобретают сорбенты японской фирмы “Toyo-Soda”. Подробные сведения о них и о некоторых других новых сорбентах приведены в прил. 3.

Формат: DJVU
Язык: Русский

Скачать учебник
Хроматография белков и нуклеиновых кислот (Остерман Л.А.)